CRISPR-Cas9技術憑借其精準、高效的基因編輯能力，在L-精氨酸高產菌株構建中展現出顯著優勢，通過靶向改造微生物的代謝通路、調控基因表達及解除反饋抑制等方式，大幅提升它的合成效率，具體應用如下：

一、增強 L -精氨酸合成的關鍵通路基因表達

L-精氨酸的生物合成途徑涉及多個關鍵酶，如谷氨酸激酶（proB）、谷氨酸-5-半醛脫氫酶（proA）、鳥氨酸氨甲酰轉移酶（argF/argI）等。CRISPR-Cas9可通過以下方式強化該通路：

激活關鍵基因啟動子：利用CRISPR激活系統（如dCas9結合激活因子）靶向修飾關鍵酶基因的啟動子區域，提高其轉錄效率。例如，在大腸桿菌或谷氨酸棒桿菌中，針對argC（編碼 N -乙酰谷氨酸激酶）、argG（編碼精氨琥珀酸合成酶）等基因的啟動子進行編輯，增強其表達水平，從而推動代謝流向 L -精氨酸合成方向傾斜。

拷貝數擴增：通過CRISPR-Cas9介導的同源重組，將L-精氨酸合成相關的基因簇（如 arg 操縱子）整合到菌株的染色體多拷貝位點或質粒中，增加基因劑量，提升酶的合成量，加速前體物質向產物的轉化。

二、敲除或弱化競爭通路與分解代謝基因

微生物代謝網絡中，與L-精氨酸合成相關的競爭通路（如脯氨酸、谷氨酸等其他氨基酸的合成途徑）會消耗共同前體（如谷氨酸），而它的分解代謝基因（如 argE 編碼的乙酰鳥氨酸酶）則會降解產物，降低積累量。CRISPR-Cas9可精準敲除或弱化這些基因：

阻斷競爭通路：例如，敲除脯氨酸合成關鍵基因proB，減少谷氨酸向脯氨酸的分流，使更多前體用于L-精氨酸合成；在谷氨酸棒桿菌中，敲除丙氨酸轉氨酶基因alaT，降低丙氨酸對谷氨酸的消耗，提升它的前體供應。

抑制分解代謝：敲除或沉默argR（編碼L-精氨酸阻遏蛋白）可解除其對arg操縱子的抑制，同時敲除argD（編碼乙酰鳥氨酸轉氨酶）等分解相關基因，減少它的降解，促進產物積累。

三、解除反饋抑制與調控系統

L - 精氨酸合成過程中，關鍵酶常受終產物的反饋抑制，例如谷氨酸激酶（proB編碼）會被L-精氨酸或脯氨酸抑制，限制合成效率。CRISPR-Cas9可通過定點突變改造這些酶的編碼基因，消除反饋抑制：

定點突變關鍵酶基因：針對proB基因中與反饋抑制相關的氨基酸位點進行編輯（如將大腸桿菌proB基因的第143位甘氨酸突變為天冬氨酸），使突變后的谷氨酸激酶不再受L-精氨酸抑制，持續催化反應進行。

改造調控蛋白：敲除或突變L-精氨酸的全局調控基因（如某些轉錄抑制因子基因），解除其對合成通路的負調控，確保關鍵基因持續表達。

四、優化菌株的生長與代謝適應性

高產菌株需在積累大量L-精氨酸的同時保持良好的生長狀態，CRISPR-Cas9可通過改造細胞膜轉運蛋白基因或應激相關基因，提升菌株的耐受性和物質轉運效率：

增強產物外排：編輯L-精氨酸轉運蛋白基因（如 argT），增強其外排功能，減少胞內產物積累對細胞的毒性，同時避免反饋抑制的激活。

提升環境適應性：敲除或修飾與氧化應激、滲透壓應激相關的負調控基因，增強菌株在高密度發酵環境下的存活能力，確保代謝效率穩定。

通過上述多維度的基因編輯策略，CRISPR-Cas9 技術可精準重塑微生物的代謝網絡，顯著提高L-精氨酸的合成效率，為工業化高產菌株的構建提供了高效、可控的技術手段，目前已在大腸桿菌、谷氨酸棒桿菌、釀酒酵母等菌株中實現了L-精氨酸產量的大幅提升。

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