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輔酶是一大類有機輔助因子的總稱，是酶催化氧化還原反應、基團轉移和異構反應的必須因子。它們在酶催化反應中承擔傳遞電子、原子或基團的功能。輔酶也可以被視為第二底物，因為在催化反應發生時，輔酶發生的化學變化與底物正好相反。

輔酶（coenzyme）是一類可以將化學基團從一個酶轉移到另一個酶上的有機小分子，與酶較為松散地結合，對于特定酶的活性發揮是必要的。有許多維他命及其衍生物，如硫胺素和葉酸，都屬于輔酶。這些化合物無法由人體合成，必須通過飲食補充。不同的輔酶能夠攜帶的化學基團也不同：NAD+或NADP+攜帶還原性氫，輔酶A攜帶乙酰基，葉酸攜帶甲酰基，S-腺苷基蛋氨酸也可攜帶甲酰基。

與酶蛋白結合疏松，用透析法容易與蛋白部分分開的有機小分子。

由于輔酶在酶催化反應中其化學組分發生了變化，因此可以認為輔酶是一種特殊的底物或者稱為“第二底物”。這種所謂的第二底物可以被許多酶所利用。例如，已知有約七百種酶可以利用輔酶NADH進行催化。